體外診斷試劑產(chǎn)品注冊技術(shù)審評報告
產(chǎn)品中文名 稱:腦炎/腦膜炎多重病原體核酸聯(lián)合檢測 試劑盒(封閉巢式多重 PCR 熔解曲線法)
產(chǎn)品英文(原文)名稱:FilmArray? Meningitis/Encephalitis (ME) Panel
產(chǎn)品管理類 別:第三類
申 請 人 名 稱:拜奧法爾診斷有限責(zé)任公司 BioFire Diagnostics, LLC
國家藥品監(jiān)督管理局
醫(yī)療器械審評中心
基本信息
一、申請人名稱
拜奧法爾診斷有限責(zé)任公司BioFire Diagnostics, LLC
二、申請人住所
515 Colorow Drive, Salt Lake City, Utah 84108, USA
三、生產(chǎn)地址
515 Colorow Drive, Salt Lake City, Utah 84108, USA
技術(shù)審評概述
一、產(chǎn)品概述
(一)產(chǎn)品主要組成成分 本試劑盒包含以下組分,主要組成成分見表 1。
表 1 試劑盒主要組成成分
序號 | 名稱 | 主要成分 |
1 | FilmArray ME 測試條 | 每個測試條內(nèi)含裂殖酵母程序質(zhì)控品、 清洗緩沖液、洗脫緩沖液、PCR1 和 PCR2預(yù)混液、Tris-EDTA 緩沖液、 PCR1 引物和 PCR2 引物陣列 |
2 | 樣本緩沖液 由 | 由鹽酸胍、Triton X100、醋酸鈉和水組 成,置于一次性使用安瓿瓶中 |
3 | 溶解液 | 試劑水化用水,置于一次性使用藍色注 射管中 |
4 | 一次性使用紅色樣本注射管 | / |
5 | 獨立包裝移液管 | / |
(二)產(chǎn)品預(yù)期用途
本產(chǎn)品用于體外定性檢測具有腦膜炎及/或腦炎體征及/或癥 狀的人群的腦脊液 (CSF)樣本中的 14 種細菌、病毒和酵母菌的核 酸。包括:大腸埃希菌 K1 株、流感嗜血桿菌、單核細胞增生李 斯特菌、腦膜炎奈瑟菌(有莢膜)、無乳鏈球菌、肺炎鏈球菌; 巨細胞病毒、腸道病毒、單純皰疹病毒 1 型、單純皰疹病毒 2 型、 人皰疹病毒6 型、人雙??刹《?、水痘-帶狀皰疹病毒;新型隱球 菌(新生/格特)
中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)感染是引發(fā)腦及/或腦周圍的腦膜組 織炎癥(即腦炎、腦膜腦炎;在此統(tǒng)稱為 ME)的原因。約有 15% 的感染具有致死性,而其他可能會導(dǎo)致終身殘疾,例如截肢、視 力和聽力缺陷、癲癇和學(xué)習(xí)/記憶功能異常。本產(chǎn)品可用于從腦 脊液(CSF)中檢測鑒定出 14 種潛在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染相關(guān)病原 體。可在大約一小時左右通過本產(chǎn)品檢測獲得所測樣本的結(jié)果。 本產(chǎn)品是診斷腦膜炎及/或腦炎相關(guān)的病原體的一種輔助手 段,所得檢測結(jié)果應(yīng)結(jié)合其他臨床、流行病學(xué)和實驗室數(shù)據(jù)使用。 檢測的結(jié)果不應(yīng)用作診斷、治療或其他患者處置決策的唯一依據(jù)。 陽性結(jié)果不能排除與產(chǎn)品未涵蓋的微生物存在共感染的情況。檢 測到的病原體不一定是疾病的明確病因。陰性結(jié)果并不能排除中 樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)感染。
(三)產(chǎn)品包裝規(guī)格
貨號(RFIT-ASY-0118):30 測試/盒;
貨號(RFIT-ASY-0119):6 測試/盒。
(四)產(chǎn)品檢驗原理
本產(chǎn)品采用多重巢式 PCR 擴增并結(jié)合熔解曲線分析,對通 過腰椎穿刺獲得的腦脊液樣本中的上述 14 種病原體核酸進行檢 測。
產(chǎn)品是一種一次性封閉檢測試劑,其中包含分離、擴增和檢 測所需的所有成分。測試條的硬質(zhì)塑料組件內(nèi)裝有凍干試劑。測 試條的軟質(zhì)塑料部分含有多個囊泡,在其中進行各個反應(yīng)步驟。
產(chǎn)品結(jié)構(gòu)如下圖所示。
用戶將樣本加載到測試條中,隨后將測試條放入 FilmArray 系統(tǒng),由儀器自動進行以下操作及檢測:
1.核酸純化:核酸純化發(fā)生在測試條的前三個反應(yīng)區(qū)。樣本 通過瓷珠進行機械研磨破碎,并配合相應(yīng)化學(xué)試劑通過磁珠技術(shù) 進行樣本中核酸的捕獲、洗滌和洗脫釋放。
2.逆轉(zhuǎn)錄和第 1 輪多重 PCR:測試條檢測的部分病原體屬于 RNA病毒,因此在擴增前需運行逆轉(zhuǎn)錄步驟將病毒RNA轉(zhuǎn)化為 cDNA。純化后的核酸溶液與預(yù)熱的預(yù)混試劑混合以啟動逆轉(zhuǎn)錄 步驟和隨后的多重PCR反應(yīng),第1階段PCR的反應(yīng)體系中包含數(shù)十 對引物,多個PCR反應(yīng)同時在一個反應(yīng)體系中進行,用于富集樣 本中存在的病原體核酸片斷。
3.第 2 輪巢氏 PCR:第 1 階段PCR反應(yīng)的產(chǎn)物經(jīng)稀釋后與含 有DNA結(jié)合染料的第二輪PCR試劑混合。將該混合溶液分配到第2階段PCR的102孔陣列當(dāng)中。該陣列的各個孔位中已包含用于不 同病原體檢測的引物(每種在不同的孔位中重復(fù)三次)和陽性質(zhì) 控模板材料,用于檢測各種待測病原體的特定核酸序列。第2階 段PCR反應(yīng)使用的巢式引物結(jié)合在第1階段多重PCR反應(yīng)特異性產(chǎn) 物內(nèi)部,提高了反應(yīng)的靈敏度和特異性。
4. DNA 熔解曲線分析:在第2階段PCR反應(yīng)之后,系統(tǒng)緩慢 升高溫度并監(jiān)測和分析第2階段PCR反應(yīng)陣列中每個孔的熒光來 生成熔解曲線。特定PCR產(chǎn)物解鏈時的溫度(熔解溫度或 Tm) 恒定且可預(yù)測,F(xiàn)ilmArray 軟件自動評估每個檢測病原體在三個 重復(fù)孔中的數(shù)據(jù)來報告結(jié)果。
二、臨床前研究概述
(一)主要原材料
1.主要原材料的選擇 本產(chǎn)品的主要原材料包括:DNA 聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、 引物等。引物由申請人設(shè)計并生產(chǎn),其他主要原材料均購自外部 供應(yīng)商。申請人選擇有資質(zhì)的供應(yīng)商提供的原料,通過功能性試 驗,確定了原材料的適用性,制定了各主要原材料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并 經(jīng)檢驗合格。
2.企業(yè)參考品和質(zhì)控品設(shè)置情況 每個檢測試劑均包含兩個質(zhì)控品:RNA 過程質(zhì)控品和 PCR2 質(zhì)控,在每次檢測中隨樣本運行。RNA 過程質(zhì)控品為真實樣本, 即純化的粟酒裂殖酵母。酵母菌為凍干形態(tài),在裝載樣本后得以 溶解,并經(jīng)歷檢測過程的各個階段,包括裂解、核酸純化、逆轉(zhuǎn)錄、第 1 輪 PCR、稀釋、第 2 輪 PCR 和熔解曲線分析。陽性結(jié)果 表示測試條中的所有步驟均執(zhí)行成功。PCR2 質(zhì)控由一對退火的 互補寡核苷酸組成,在產(chǎn)品生產(chǎn)中與其他引物一起添加在陣列中, 參與 PCR2 擴增反應(yīng),用于確認 PCR2 擴增步驟中陣列填充和熒 光檢測的正確性。 企業(yè)內(nèi)部參考品包括陽性參考品和陰性參考品。陽性質(zhì)控品 由涵蓋檢測范圍內(nèi)所有病原體不同亞型的混合物組成。陰性參考 品用于確保測試條未出現(xiàn)因污染或非特異性擴增而引起的非預(yù)期 的陽性結(jié)果。
(二)生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究
申請人通過對試劑主要生產(chǎn)工藝如凍干工藝的研究,確定了 最佳生產(chǎn)工藝。申請人對反應(yīng)體系中樣本量、引物濃度、DNA 聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、離子的濃度以及逆轉(zhuǎn)錄的時間及溫 度、PCR1 和 PCR2 的退火延伸時間及溫度、循環(huán)數(shù)的選擇等進 行優(yōu)化,并通過驗證最終確定了最佳反應(yīng)體系。
(三)分析性能評估
本產(chǎn)品分析性能評估內(nèi)容包括最低檢出限、包容性、分析特 異性、精密度、干擾物質(zhì)和競爭性抑制等。申請人提交了有效運 行 的 質(zhì) 量 體 系 下 生 產(chǎn) 的 三 批 產(chǎn) 品 在 適 用 機 型 FilmArray、 FilmArray 2.0 和 FilmArray Torch 上進行了性能評估。
1.最低檢出限
通過對含有已知濃度的一種至五個微生物(細菌、病毒和酵 母菌)的系列稀釋樣本進行檢測,對本產(chǎn)品的檢出限進行預(yù)估。
通過對含有預(yù)估檢出限濃度分析物的樣本進行 20 次重復(fù)檢測, 來確認檢出限。如果在 20 次重復(fù)檢測中至少 19 次為陽性 (19/20=95%),則可確認檢出限。14 種病原體的檢出限數(shù)據(jù)如下。
微生物 | 菌種/分離株 | 最低檢出限 |
細菌 | ||
大腸埃希菌 K1 株 | 大腸埃希菌 K1,菌株 C5 [Bort], O18ac:K1:H7 型 ATCC 700973 | 1 × 103 CFU/mL |
流感嗜血桿 菌 | 流感嗜血桿菌,菌株 AMC 36-A-1 [572],b 型,生物型 I ATCC 10211 | 1 × 103 CFU/mL |
流感嗜血桿菌,菌株 AMC 36-A-1 [572],b 型,生物型 I ATCC 10211 | 單核細胞增生李斯特菌,菌株 1071/53,4b 型 ATCC 13932 | 1 × 103 CFU/mL |
腦膜炎奈瑟 菌(有莢 膜) | 腦膜炎奈瑟菌,菌株 M-1574 [199/W135] ATCC 43744 | 100 CFU/mL |
無乳鏈球菌 | 無乳鏈球菌,模式菌株,G19,B 群 ATCC 13813 | 1 × 103 CFU/mL |
肺炎鏈球菌 | 肺炎鏈球菌,菌株 SV 1,血清型 1 ATCC 33400 | 100 個細胞/mL |
病毒 | ||
巨細胞病毒 | 巨細胞病毒,菌株 AD-169 Zeptometrix 0810003CF | 100 TCID50/mL |
腸道病毒 (A-D 屬) | 柯薩奇病毒 A6,A 屬,菌株 Gdula ATCC VR-1801 | 50 TCID50/mL |
柯薩奇病毒 A9,B 屬 Zeptometrix 0810017CF | 5 TCID50/mL | |
柯薩奇病毒 A9,B 屬 Zeptometrix 0810017CF | 5 TCID50/mL | |
EV 70,D 屬,菌株 J670/71 ATCC VR-836 | 50 TCID50/mL | |
單純皰疹病毒 1 型 | 單純皰疹病毒 1 型,菌株 MacIntyre Zeptometrix 0810005CF | 250 TCID50/mL |
單純皰疹病毒 2 型 | 單純皰疹病毒 1 型,菌株 MacIntyre Zeptometrix 0810005CF | 50 TCID50/mL |
人皰疹病毒 6 型 | HHV-6A,菌株 U1102 NCPV 0003121v | 1 × 104 拷貝數(shù) /mL |
HHV-6B,菌株 HST NCPV 0006111v | 1 × 104 拷貝數(shù) /mL | |
人雙??刹《?/td> | 人雙埃可病毒,3 型 Zeptometrix 0810147CF | 500 TCID50/mL |
水痘-帶狀皰 疹病毒 | 水痘-帶狀皰疹病毒,菌株 Ellen Zeptometrix 0810171CF | 0.10 TCID50/mL |
酵母菌 | ||
新型隱球菌 (新生/格 特) | 新生隱球菌,格魯比變種,模式菌 株,H99 [H99JP, NYSD 1649] ATCC 208821 | 100 CFU/mL |
格特隱球菌,菌株 A6MR38, AFLP6C,VGIIc ATCC MYA-4877 | 100 CFU/mL |
選擇能夠代表測試條包容性的 101 個分離株進行檢測,所選 分離株能夠代表病原體相關(guān)的種屬、亞種或血清型,在接近檢出 限濃度的水平進行檢測。結(jié)果顯示測試條能正確檢出所有分離株。 同時對本產(chǎn)品可以檢測卻無法進行實驗測試的不常見的菌株或血 清型進行了生物信息學(xué)分析以預(yù)測其反應(yīng)性,未觀察到任何漏檢 情形。
微生物 | 分離株 ID | 來源 | 類型/菌株 | 檢測濃度 |
大腸埃希菌 K1 株 | ATCC 700973 | ATCC | 血清型 O18ac:K1:H7 | 1×103 CFU/mL |
BEI N-17666 | BEI | 血清型 O2:K1:H4 | 3×103 CFU/mL | |
BEI NR-17674 | BEI | 血清型 O16:K1:H- | 3×103 CFU/mL | |
NCTC 9007 | NCTC | 血清型 O9:K1:H- | 3×103 CFU/mL | |
NCTC 9045 | NCTC | 血清型 O45:K1:H10 | 3×103 CFU/mL | |
流感嗜血桿 菌 | ATCC 51907 | ATCC | 非分型 [菌株Rd [KW20]] | 3 × 103 CFU/mL |
ATCC 1116 | ATCC | 非分型埃及生物群 [菌株類型,180-a] | 3 × 103 CFU/mL | |
ATCC 9006 | ATCC | 非分型埃及生物群 [菌株類型,180-a] | 3 × 103 CFU/mL | |
ATCC 31512 | ATCC | b 型 [菌株 Rab] | 3 × 103 CFU/mL | |
ATCC 10211 | ATCC | b 型 [生物型 1] | 1 × 103 CFU/mL | |
ATCC 49699 | ATCC | c 型 [菌株 C 9007] | 3 × 103 CFU/mL | |
ATCC 9008 | ATCC | d 型 [菌株 AMC 36-A-6] | 3 × 103 CFU/mL | |
ATCC 8142 | ATCC | e 型 [菌株 AMC 36-A-7] | 3 × 103 CFU/mL | |
ATCC 700223 | ATCC | f 型 [菌株 GA1264] | 3 × 103 CFU/mL | |
單核細胞增 生李斯特菌 | FSL-J2-020 | Cornell U | 1/2a 型 | 3 × 103 CFU/mL |
FSL-C1-056 | Cornell U | 1/2a 型 | 3 × 103 CFU/mL | |
FSL-J2-064 | Cornell U | 1/2b 型 | 3 × 103 CFU/mL | |
HUM2009042206 | CDPH | 1/2b 型 | 3 × 103 CFU/mL | |
FSL-J1-110 | Cornell U | 4b 型 | 3 × 103 CFU/mL | |
ATCC 13932 | ATCC | 4b 型 | 3 × 103 CFU/mL | |
腦膜炎奈瑟 菌(有莢 膜) | ATCC 43744 | ATCC | 血清型W135 | 100 CFU/mL |
ATCC 13077 | ATCC | 血清型A | 300 CFU/mL | |
ATCC 13090 | ATCC | 血清型B | 300 CFU/mL | |
ATCC13102 | ATCC | 血清型C | 300 CFU/mL | |
ATCC 13113 | ATCC | 血清型D | 300 CFU/mL | |
ATCC 35561 | ATCC | 血清型Y | 300 CFU/mL | |
DNA(ctrA 變體) Jaton 等 | 具有變體 ctrA基因的 DNA | CtrA 變體 | 300 CFU/mL | |
無乳鏈球菌 | ATCC 13813 | ATCC | 血清型 Ia/c | 1 ×103 CFU/mL |
ATCC 12403 | ATCC | 血清型 III | 3 ×103 CFU/mL | |
ATCC BAA-611 | ATCC | 血清型 V | 3 ×103 CFU/mL | |
臨床分離株 20100107CI03 | 臨床分離株 | 未知 | 3 ×103 CFU/mL | |
NCTC 8017 | NCTC | 未知 | 3 ×103 CFU/mL | |
肺炎鏈球菌 | ATCC 33400 | ATCC | 血清型 1 | 100 個細胞 /mL |
ATCC BAA-334 | ATCC | 血清型 4 | 300 個細胞 /mL | |
ATCC BAA-341 | ATCC | 血清型 5 | 300 個細胞 /mL | |
NCTC 11900 | NCTC | 血清型 11A | 300 個細胞 /mL | |
ATCC 700672 | ATCC | 血清型 14 | 300 個細胞 /mL | |
ATCC 700673 | ATCC | 血清型 19A | 300 個細胞 /mL | |
ATCC 700673 | ATCC | 血清型 19F | 100 個細胞 /mL | |
巨細胞病毒 | Zeptometrix 0810003CF (ATCC VR538 | Zeptometrix | AD-169 | 100 TCID50/mL |
ATCC VR-977 | ATCC | Towne | 1.3 × 104 拷貝 數(shù)/mL | |
ATCC VR-159 | ATCC | Merlin | 1.3 × 104 拷貝 數(shù)/mL | |
ATCC VR-807 | ATCC | Davis | 1.3 × 104 拷貝 數(shù)/mL | |
NCPV 0302162v | NCPV | Toledo | 1.3 × 104 拷貝 數(shù)/mL | |
腸道病毒 涵蓋 A、 B、C、D 所 有 4 組 | ATCC VR-1801 | ATCC | 柯薩奇病毒A6, A組 | 50 TCID50/mL |
ATCC VR-168 | ATCC | 柯薩奇病毒A10, A組 | 50 TCID50/mL | |
NCPV 0812071v | NCPV | 柯薩奇病毒A16, A組 | 50 TCID50/mL | |